预染蛋白marker简介

预染蛋白Marker(Prestained Marker)是蛋白电泳及免疫印迹实验不可或缺的工具。其原理是将几种不同分子量的标准蛋白与染料共价耦联,让我们在电泳过程中或者转膜时可以用肉眼直接观察。

作为在Western Blot实验中的重要工具，使用过程中难免会遇到一些问题，下面列举了一些常见问题及解决方案，让我们一起来看看吧！

预染蛋白marker常见问题及解决方法

Marker 条带浅

marker被洗脱

值得注意的是染料本身不会从蛋白质上洗脱，上文有讲到标准蛋白和染料是共价结合的。那么造成Marker条带浅的原因有极大的可能是封闭/洗涤液中的洗涤剂将一部分蛋白质从膜上洗脱。

解决方案：建议选用合适的封闭/洗涤液，减少Marker被洗脱；另外较小孔径的膜可以在封闭和洗涤过程中更好地保留蛋白质，因此，为了获得绝的分辨率和蛋白质保留率，推荐使用0.2 µm代替0.45 µm的膜。

marker变性

另外，Marker本质是蛋白质，一切会引起蛋白质变性的操作都会使其效果大打折扣。如：反复冻融，高温环境，加热或煮沸等等。

解决方案：尽量避免让蛋白变性的操作。

Marker转膜前条带缺失

可以留意一下发现Marker条带缺失的时间，若是转膜前发现可能原因有：

①凝胶浓度不当

凝胶浓度过低可能导致小分子量条带无法很好地分散；而过高则可能使大分子量条带无法充分展开。

解决方案：可以根据蛋白Marker的分子量范围选择合适的凝胶浓度。

②电泳时间不当

电泳时间过短可能导致部分条带未能完全分离；而电泳时间过长则可能使条带跑出凝胶。

解决方案：注意电泳时长，建议在溴酚蓝指示剂前沿刚跑出胶时停止电泳。

③蛋白Marker降解

可能蛋白Marker本身降解或在电泳过程中降解，也会导致条带缺失。

解决方案：检查marker是否在有效日期内；储存环境是否合格；电泳过程中是否温度过高导致蛋白变性。

Marker转膜后条带缺失

可以查看凝胶上是否有缺失的条带。如果有，说明转膜失败。可以依次从以下几个角度排查问题："三明治"组装是否正确→转膜缓冲液浓度是否正确→转膜时的电压时长等是否正确。

若是凝胶是没有缺失的条带，则说明电泳出现问题。可以从以下几个角度排查问题：电泳电压是否过高→胶浓度是否合适→‌Marker失效‌（保存不当导致变性或者超过效期）。

Marker条带弥散或变形

①上样量过多

上样量过多会导致蛋白在凝胶中扩散不均匀，从而出现弥散现象。

解决方案：建议减少上样量，可以按照说明书推荐上样量来操作。

②电泳条件不当

电压过高或电泳时间过长会导致电泳缓冲液温度升高，进而使蛋白条带弥散。

解决方案：建议根据产品说明书调整电泳条件。

③凝胶浓度不当

凝胶浓度过低可能导致小分子蛋白弥散，而凝胶浓度过高则可能影响大分子蛋白的分离。

解决方案：建议根据蛋白Marker的分子量范围选择合适的凝胶浓度。

④缓冲液问题

电泳缓冲液不是现配的或pH值不在缓冲范围内，也可能导致条带弥散。

解决方案：可以使用新鲜的电泳缓冲液，并在使用前预冷缓冲液。

⑤边缘效应

如果蛋白Marker放置在凝胶的边缘泳道，可能由于边缘效应导致条带变形或弥散。

解决方案：条件许可的条件下，尽量避免边缘条带。

总结

总体看下来，蛋白Marker条带出现问题的主要原因就是电泳参数，转膜条件，缓冲液，储存条件等不当。

可以依次检查实验条件是否有问题：检查marker储存/批次 → 检查凝胶/缓冲液 → 调整电泳参数 → 验证转膜条件 。