概述

免疫细胞化学/免疫荧光（ICC/IF）利用抗原与抗体之间的特异性结合原理，通过荧光标记的二抗进行显色，从而确定细胞内靶标抗原（如多肽和蛋白质）的存在。这种技术可以对抗原进行定位、定性及相对定量的研究。该技术广泛应用于细胞生物学、病理学、肿瘤学等领域，能够帮助研究人员揭示细胞内蛋白质的表达和分布。

实验流程

ICC实验包括以下几个步骤：

①细胞培养：

细胞培养是ICC/IF实验的基础，细胞状态直接影响ICC/IF实验结果。因此进行ICC/IF实验前需关注细胞形态是否正常。

如果实验用细胞为贴壁细胞，可将细胞爬片置于培养皿中，贴壁细胞消化重悬后加入培养皿中，静置培养，让细胞贴壁至少24h。实验前细胞密度以60-70%最佳。

如果实验用细胞为悬浮细胞，可将细胞重悬于 PBS 中，调整浓度至 1x10^5/ml，滴加至细胞爬片上，37℃静置 10 分钟。

②固定：

细胞固定是为了保持细胞的形态结构并防止抗原降解。常用的固定剂主要分为交联试剂（甲醛、4%多聚甲醛等）和有机溶剂（甲醇、丙酮等）两大类。固定剂的选择没有通用规则，不同的靶标蛋白需进行预实验尝试不同的固定液剂及固定条件，以达到最佳的实验效果。

常用的固定剂及孵育条件有：4%多聚甲醛于室温孵育10分钟，或者-20℃预冷的甲醇于4℃孵育10分钟。

固定后使用PBS清洗5次，每次5分钟。

③通透处理：

对细胞膜进行打孔处理，使抗体能够进入细胞内与抗原结合。使用有机溶剂固定的细胞可以不进行通透处理。该步骤通常使用含有0.1-0.25% Triton X-100的PBS于室温孵育10分钟。

通透后使用PBST清洗3次，每次5分钟。

④封闭：

封闭可以减少抗体与样品的非特异性结合，从而降低背景及减少假阳性的产生。通常可以使用含1%BSA及10%血清（使用二抗宿主种属来源的血清）的PBST，于室温封闭1小时。

封闭后使用PBST清洗3次，每次5分钟。

⑤一抗孵育：

使用特异性的一抗孵育样本，与细胞内的靶抗原结合。可以使用含1% BSA的PBST稀释一抗，抗体浓度应参考抗体说明书并根据实际情况进行优化，通常孵育条件为室温1小时，或者4℃过夜。

一抗孵育后使用PBST清洗3次，每次5分钟。

⑥二抗孵育：

使用荧光二抗孵育样本。可以使用含1% BSA的PBST或PBS稀释二抗，抗体浓度应参考抗体说明书并根据实际情况进行优化，通常孵育条件为室温30-45分钟。荧光二抗需要注意避光保存，二抗孵育之后的步骤也应注意避光操作。

一抗孵育后使用PBST清洗1次，5分钟。

⑦复染：

使用DAPI溶液孵育样本。DAPI 是一种能够与DNA强力结合的荧光染料，可用于细胞核染色从而定位细胞及亚细胞结构。通常使用的DAPI溶液浓度为50-500ng/ml，室温孵育5分钟。

DAPI染色后使用PBST清洗3次，每次5分钟，之后再用蒸馏水清洗一次。

⑧封片与观察：

在载玻片上滴加适量封片剂，细胞爬片有细胞的一面向下置于载玻片上进行封片。尽快用荧光显微镜观察并记录实验结果。

常用荧光标记

脑组织属于多脂质特殊组织，建议用液氮研磨组织，用强力的蛋白提取液提取蛋白，防止蛋白降解（全程冰上操作，蛋白提取液要预先预冷。不要4℃放置太长时间）。在4℃旋转混合仪上进行充分裂解30min，裂解液要充分离心4℃，15000rpm，30min。小心的避开脂质层，取上清再加足量或者过量的Laemmli buffer，95℃，20min加热变性，如果看不见明显的脂质层，可以将离心时间延长至60min。      核蛋白和膜蛋白，这类蛋白的内源性表达量大部分较低，需通过专门的提取方式进行富集，然后裂解得到待测样本，这种类型蛋白的提取Kit商业应用已经很成熟，国内可供选择的品牌也很多。

二抗，又名“secondary antibody”,常出现在需要使用一抗的免疫实验中。 按照功能可分为常规标记二抗和荧光二抗两种。二抗的结合对象为一抗，其以一抗本身 （如兔IgG）为靶标，通常在产品名称中用类似“Goat Anti-Rabbit（即山羊抗兔）”来标识靶标识别关系。以“Goat Anti-Rabbit（即山羊抗兔）”为例，“Goat-山羊”为二抗的抗体来源种属（即“宿主”），“Rabbit-兔”为二抗所要结合的一抗的抗体来源种属。 当某一免疫反应体系中的一抗来源为“Mouse-小鼠”时，即可选用“Goat Anti-Mouse”或“Rabbit Anti-Mouse”等二抗来完成反应。 二抗与一抗的抗体来源种属，应保持不同，以避免抗体内自相反应。

具体储存建议以产品说明书及产品标签为准。

1.一般情况下,浓缩抗体可以在2-8°C条件下储存12周

2.为延长抗体使用期限,建议客户收到抗体后立即冻存于-20°C冰箱(50%甘油的凝固点为-24°C）

3.长期储存,建议将抗体分装保存在温度设置更低的冰箱中(分裝目的是为了减少反复冻融对抗体活性的损害,同时避免多次从同-管中吸取抗体造成污染)。