概述

免疫细胞化学/免疫荧光（ICC/IF）利用抗原与抗体之间的特异性结合原理，通过荧光标记的二抗进行显色，从而确定细胞内靶标抗原（如多肽和蛋白质）的存在。这种技术可以对抗原进行定位、定性及相对定量的研究。该技术广泛应用于细胞生物学、病理学、肿瘤学等领域，能够帮助研究人员揭示细胞内蛋白质的表达和分布。

实验流程

ICC实验包括以下几个步骤：

①细胞培养：

细胞培养是ICC/IF实验的基础，细胞状态直接影响ICC/IF实验结果。因此进行ICC/IF实验前需关注细胞形态是否正常。

如果实验用细胞为贴壁细胞，可将细胞爬片置于培养皿中，贴壁细胞消化重悬后加入培养皿中，静置培养，让细胞贴壁至少24h。实验前细胞密度以60-70%最佳。

如果实验用细胞为悬浮细胞，可将细胞重悬于 PBS 中，调整浓度至 1x10^5/ml，滴加至细胞爬片上，37℃静置 10 分钟。

②固定：

细胞固定是为了保持细胞的形态结构并防止抗原降解。常用的固定剂主要分为交联试剂（甲醛、4%多聚甲醛等）和有机溶剂（甲醇、丙酮等）两大类。固定剂的选择没有通用规则，不同的靶标蛋白需进行预实验尝试不同的固定液剂及固定条件，以达到最佳的实验效果。

常用的固定剂及孵育条件有：4%多聚甲醛于室温孵育10分钟，或者-20℃预冷的甲醇于4℃孵育10分钟。

固定后使用PBS清洗5次，每次5分钟。

③通透处理：

对细胞膜进行打孔处理，使抗体能够进入细胞内与抗原结合。使用有机溶剂固定的细胞可以不进行通透处理。该步骤通常使用含有0.1-0.25% Triton X-100的PBS于室温孵育10分钟。

通透后使用PBST清洗3次，每次5分钟。

④封闭：

封闭可以减少抗体与样品的非特异性结合，从而降低背景及减少假阳性的产生。通常可以使用含1%BSA及10%血清（使用二抗宿主种属来源的血清）的PBST，于室温封闭1小时。

封闭后使用PBST清洗3次，每次5分钟。

⑤一抗孵育：

使用特异性的一抗孵育样本，与细胞内的靶抗原结合。可以使用含1% BSA的PBST稀释一抗，抗体浓度应参考抗体说明书并根据实际情况进行优化，通常孵育条件为室温1小时，或者4℃过夜。

一抗孵育后使用PBST清洗3次，每次5分钟。

⑥二抗孵育：

使用荧光二抗孵育样本。可以使用含1% BSA的PBST或PBS稀释二抗，抗体浓度应参考抗体说明书并根据实际情况进行优化，通常孵育条件为室温30-45分钟。荧光二抗需要注意避光保存，二抗孵育之后的步骤也应注意避光操作。

一抗孵育后使用PBST清洗1次，5分钟。

⑦复染：

使用DAPI溶液孵育样本。DAPI 是一种能够与DNA强力结合的荧光染料，可用于细胞核染色从而定位细胞及亚细胞结构。通常使用的DAPI溶液浓度为50-500ng/ml，室温孵育5分钟。

DAPI染色后使用PBST清洗3次，每次5分钟，之后再用蒸馏水清洗一次。

⑧封片与观察：

在载玻片上滴加适量封片剂，细胞爬片有细胞的一面向下置于载玻片上进行封片。尽快用荧光显微镜观察并记录实验结果。

常用荧光标记