实验原理

免疫印迹(Immunoblotting) 又称蛋白质印迹(Western blot，WB)，一种广泛用于检测复杂样品中特定蛋白质的免疫学检测技术。它利用 SDS-PAGE 技术将生物样品中的蛋白质按分子量的大小在凝胶上分离开，然后用电转移的方法将蛋白转移到固相膜上，以固相膜上的蛋白质作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶标记或荧光团偶联的第二抗体起反应，通过化学发光或荧光成像等方法实现检测特异性目的基因表达的蛋白质。

实验流程

1.样本准备

1.1细胞裂解液的制备

1.1.1细胞的收集

①悬浮细胞：100–500 g离心 5min，用预冷 PBS 洗涤细胞两次；100–500 g离心 5min，弃上清；

②贴壁细胞：刮下细胞，100–500 g离心 5min，弃上清，用预冷 PBS 洗涤两次，100–500 g离心 5min，弃上清。

1.1.2按细胞数量加入适量的裂解缓冲液，重悬细胞，冰上孵育15min。

1.1.3超声处理（超声时间及强度依据仪器而定），破碎细胞。

1.1.4 15000 ~17000 g 离心5~10min，取上清液，弃去沉淀。

1.2组织裂解液的制备

1.2.1将组织剪碎，用液氮研磨或玻璃匀浆器研磨；

1.2.2按组织量加入适量的裂解缓冲液，混匀，冰上孵育15min。

1.2.3超声处理（超声时间及强度依据仪器而定），破碎细胞。

1.2.4 15000 ~17000 g 离心5~10min，取上清液，弃去沉淀。

2.蛋白定量

采用BCA法定量样品中的蛋白质（具体操作参考试剂盒说明书）。加入上样缓冲液使定量好的样品终浓度为1-2mg/ml，分装，-80℃保存。

3.电泳

3.1根据目的蛋白的大小，确定凝胶浓度并配制凝胶。

3.2将裂解液在 95–100°C 下加热 5 min，冷却，微量离心机内离心 5 min；

3.3将样品（上样量：总蛋白：10−40 µg ；10−500 ng 纯化蛋白）加到凝胶中；

3.4开始电泳，跑胶的电压及时间根据使用的仪器及靶蛋白确定。

4.电转

采用湿转法，根据靶蛋白大小决定使用膜的孔径。如果使用PVDF 膜，则使用前需在甲醇中浸泡1-2 min后再转入转移液中。转膜时间及电压根据靶蛋白及使用的仪器确定。

5.膜封闭及抗体孵育

5.1膜封闭

5.1.1将电转后的膜取出，用TBST洗涤 5 min；

5.1.2将膜放入封闭缓冲液中，4℃孵育过夜，或室温下孵育1小时；

5.1.3TBST洗涤三次，每次5 min；

5.2孵育一抗

5.2.1加入稀释好的一抗，4℃孵育过夜，或室温下孵育1小时；

5.2.2TBST洗涤三次，每次5 min；

5.3孵育二抗

5.3.1加入稀释好的二抗，室温下孵育1小时；

5.3.2 TBST洗涤三次，每次5 min；

6.检测

6.1加入底物溶液，孵育不超过 5 min（具体时间根据所使用试剂决定）；

6.2去除膜上多余显影液，勿令其干燥；

6.3将膜放于成像托盘上，使用化学发光成像系统曝光印迹。

7.数据分析

概述

免疫细胞化学/免疫荧光（ICC/IF）利用抗原与抗体之间的特异性结合原理，通过荧光标记的二抗进行显色，从而确定细胞内靶标抗原（如多肽和蛋白质）的存在。这种技术可以对抗原进行定位、定性及相对定量的研究。该技术广泛应用于细胞生物学、病理学、肿瘤学等领域，能够帮助研究人员揭示细胞内蛋白质的表达和分布。

实验流程

ICC实验包括以下几个步骤：

1.细胞培养：

细胞培养是ICC/IF实验的基础，细胞状态直接影响ICC/IF实验结果。因此进行ICC/IF实验前需关注细胞形态是否正常。

①如果实验用细胞为贴壁细胞，可将细胞爬片置于培养皿中，贴壁细胞消化重悬后加入培养皿中，静置培养，让细胞贴壁至少24h。实验前细胞密度以60-70%最佳。

②如果实验用细胞为悬浮细胞，可将细胞重悬于 PBS 中，调整浓度至 1x10^5/ml，滴加至细胞爬片上，37℃静置 10 分钟。

2.固定：

细胞固定是为了保持细胞的形态结构并防止抗原降解。常用的固定剂主要分为交联试剂（甲醛、4%多聚甲醛等）和有机溶剂（甲醇、丙酮等）两大类。固定剂的选择没有通用规则，不同的靶标蛋白需进行预实验尝试不同的固定液剂及固定条件，以达到最佳的实验效果。

常用的固定剂及孵育条件有：4%多聚甲醛于室温孵育10分钟，或者-20℃预冷的甲醇于4℃孵育10分钟。

固定后使用PBS清洗5次，每次5分钟。

3.通透处理：

对细胞膜进行打孔处理，使抗体能够进入细胞内与抗原结合。使用有机溶剂固定的细胞可以不进行通透处理。该步骤通常使用含有0.1-0.25% Triton X-100的PBS于室温孵育10分钟。

通透后使用PBST清洗3次，每次5分钟。

4.封闭：

封闭可以减少抗体与样品的非特异性结合，从而降低背景及减少假阳性的产生。通常可以使用含1%BSA及10%血清（使用二抗宿主种属来源的血清）的PBST，于室温封闭1小时。

封闭后使用PBST清洗3次，每次5分钟。

5.一抗孵育：

使用特异性的一抗孵育样本，与细胞内的靶抗原结合。可以使用含1% BSA的PBST稀释一抗，抗体浓度应参考抗体说明书并根据实际情况进行优化，通常孵育条件为室温1小时，或者4℃过夜。

一抗孵育后使用PBST清洗3次，每次5分钟。

6.二抗孵育：

使用荧光二抗孵育样本。可以使用含1% BSA的PBST或PBS稀释二抗，抗体浓度应参考抗体说明书并根据实际情况进行优化，通常孵育条件为室温30-45分钟。荧光二抗需要注意避光保存，二抗孵育之后的步骤也应注意避光操作。

一抗孵育后使用PBST清洗1次，5分钟。

7.复染：

使用DAPI溶液孵育样本。DAPI 是一种能够与DNA强力结合的荧光染料，可用于细胞核染色从而定位细胞及亚细胞结构。通常使用的DAPI溶液浓度为50-500ng/ml，室温孵育5分钟。

DAPI染色后使用PBST清洗3次，每次5分钟，之后再用蒸馏水清洗一次。

8.封片与观察：

在载玻片上滴加适量封片剂，细胞爬片有细胞的一面向下置于载玻片上进行封片。尽快用荧光显微镜观察并记录实验结果。

常用荧光标记